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2020開門紅!Cancer Cell報道黑色素瘤中CDR1as功能機制
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2020-01-16 | 1343 次瀏覽 | 分享到:


CDR1as是最早報道功能機制的circRNA分子,也是目前唯一實現CNS大滿貫的circRNA分子。1月13日,Cancer Cell雜志報道了CDR1as在黑色素瘤中的功能機制研究,表明黑色素瘤中CDR1as是由LINC00632基因的轉錄產物加工形成的,可以被EZH2/PRC2沉默表達。CDR1as可結合IGF2BP3,CDR1as表達降低后可釋放IGF2BP3,改變一些靶基因的表達狀態,參與黑色素瘤的遷移侵襲及GPX4藥物敏感性([1])。

CDR1as研究的主要進展:

* 2013年,兩篇Nature報道CDR1as可競爭性結合miR-7,最早證明了circRNA具有miRNA Sponge的功能[2, 3])。miRNA Sponge功能模型也成為目前報道最多的circRNA功能模型。

* 2017年,Sicence報道敲除CDR1as小鼠大腦神經突觸間信號傳遞異常([4])(推薦閱讀:重磅!Science在線發表circRNA研究論文

* 2018年,Cell文章報道人類大腦中RNA間相互作用的網絡,報道了四種非編碼RNA“相生相克”的精彩故事([5]

* 2019年,Cell報道心臟翻譯組學研究,其中發現CDR1as可以結合在核糖體測序中被捕獲,提示該分子也可能被翻譯([6])。(推薦閱讀:Cell:心臟翻譯組學文章,證明circRNA可翻譯

* 截至目前,CDR1as的研究論文和綜述已經多達85篇,是研究報道最多的circRNA分子。


在本文中,作者發現黑色素瘤中CDR1as表達沉默與腫瘤的浸潤侵襲狀態有關,因此深入分析了黑色素瘤中CDR1as生成,表達,調控,功能方面的機制。作者發現CDR1as的表達與上游非編碼RNA基因LINC00632密切相關,并證實了CDR1as的表達是受到LINC00632表達變化而影響的。隨著黑色素瘤的進展,CDR1as表達會呈現下降趨勢,EZH2/PRC2介導了LINC00632/CDR1as Locus的表達沉默。在黑色素瘤中miR-7不是CDR1as影響侵襲遷移能力的原因,分析表明IGF2BP3的結合與這些現象有關。本文從RNA結合蛋白入手分析了CDR1as 與黑色素瘤侵襲能力的關系,并基于多種在線數據和信息分析了相關的基因和通路,藥物敏感性等。下面就讓我們一起學習一下本文:(聲明:為了清楚的表達文章的故事,有些內容與原文的順序有所區別,敬請諒解)


CDR1as在黑色素瘤中的功能是怎樣的?

作者分析了4例黑色素細胞和10例短培養黑色素瘤細胞(melanoma short-term cultures,STCs)的RNA-seq數據,分析了其中的circRNA表達情況。從測序數據中,作者分析了環狀RNA與來源基因的線性RNA表達的比值,發現CDR1as的成環比例比預期的要低。10例STCs中6例檢測不到CDR1as,作者發現另外的4例是從黑色素瘤腦轉移的病灶分離的,懷疑是由于分離的標本中摻雜了膠質細胞的緣故。黑色素瘤的細胞系中CDR1as的表達也不高。進一步分析表明相對于初發的患者,高轉移侵襲的黑色素瘤標本中CDR1as的表達顯著降低。生存分析表明,CDR1as表達最低的25%患者生存情況明顯比其余75%的患者要差。綜合這些現象,CDR1as在黑色素瘤中表達如何調控的,它的功能和機制等問題就非常值得深入探討。



圖1 黑色素瘤中CDR1as表達下調,與腫瘤侵襲有關 ([1]


為進一步證明CDR1as在黑色素瘤遷移侵襲中的作用,作者構建了Dox誘導表達靶向CDR1as的shRNA分子的模型,結果顯示在低侵襲性高表達CDR1as的黑色素瘤細胞系(WM278和WM115)中干擾CDR1as并不能顯著影響細胞增殖,但可以顯著提高細胞侵襲能力。在低表達LINC00632/CDR1as的細胞(SK-MEL-28 和 501MEL)中,干擾CDR1as對侵襲表型沒有影響。SK-MEL-28 和 501MEL細胞中過表達CDR1as能降低侵襲性,體內成瘤實驗表明,干擾CDR1as并不顯著改變腫瘤大小和生長速度,但可以顯著體提高肺轉移比例。


圖2 CDR1as降低可促進黑色素瘤轉移侵襲能力 ([1]


黑色素瘤中CDR1as的生成是如何調控的?

早期曾有報道發現CDR1as是在一個非編碼RNA LINC00632的基因內部。本文作者進一步驗證了這個假設,并證明CDR1as的表達的確與LINC00632高度相關。多種在線數據的統計結果均表明CDR1as的表達與LINC00632高度相關(相關系數r=0.86, p<0.0001),這些數據包括TCGA,GTEx,mouse neural crest-derived tissues。作者還從測序數據和PCR驗證實驗找到了LINC00632來源的兩個轉錄本(ENST00000498732和ENST00000602535)包含了CDR1as序列,證明了CDR1as從LINC00632的產物中形成。Cas9破壞3’剪切位點可顯著減少CDR1as的生成比例,但同時增加了 LINC00632的生成比例。SAM CRISPR/Cas9技術增強LINC00632的表達也會同步提高CDR1as的數目。這些數據均佐證了之前報道的CDR1as來源于非編碼RNA基因LINC00632


miR-671-5p可通過RNAi機制促進CDR1as的降解,但還沒有報道表明LINC00632是miR-671-5p的作用底物,因此作者分析了黑色素瘤組織和細胞中三者的表達關系,結果表明在病人組織中miR-671-5p的表達與CDR1as的表達僅有微弱的相關性,但細胞中的表達沒有相關性。過表達miR-671-5p可降低CDR1as的表達,但不影響LINC00632的表達,而敲降miR-671-5p并不能使得CDR1as表達值回復。綜上現象,黑色素瘤中CDR1as的表達似乎并非由miR-671-5p的調控實現,更可能是由于CDR1as的來源基因LINC00632表達的影響造成的


在線數據分析表明黑色素瘤中LINC00632基因區域(包括CDR1as在內)并不存在典型的刪除突變,但H3K27me3和H3K27ac的ChIP結果強烈提示LINC00632基因區域在黑色素瘤中存在較強的染色體關閉信號。EZH2 抑制劑GSK126處理后可明顯恢復LINC00632和CDR1as的表達。這表明黑色素瘤中LINC00632/CDR1as的表達是受到EZH2/PRC2的調控。


圖3 LINC00632/CDR1as的表達是受到EZH2/PRC2的調控 ([1]


如何探討黑色素瘤中CDR1as與miR-7的關系?

CDR1as是最早報道功能機制的circRNA分子,競爭性結合miR-7是最有代表性的miRNA sponge模型([2,3]),但CDR1as敲除的模型中也顯示,在腦組織中CDR1as還具有穩定miR-7的作用([5])。在黑色素瘤中CDR1as與miR-7的關系是怎樣的呢?


干擾CDR1as并不影響miR-7-5p的表達,也不會對miR-7結合位點熒光素酶報告基因產生影響,一些miR-7的下游基因也沒有受到影響。Cas-9敲除miR-7-1可顯著抑制miR-7表達,但不會改變細胞侵襲能力,反而在敲除miR-7-1的基礎上干擾CDR1as可提高細胞侵襲能力。這說明黑色素瘤中敲降CDR1as導致的侵襲能力增強并非由miR-7介導。


圖 4 黑色素瘤中敲降CDR1as導致的侵襲能力增強并非由miR-7介導 ([1]


黑色素瘤中CDR1as與IGF2BP3結合的作用機制

為揭示CDR1as在黑色素瘤中的作用機制,作者首先思考了CDR1as可能的相互作用蛋白。與傳統思路不同,作者首先從CLIP-seq的在線數據中分析了可能的結合蛋白,并從中發現了IGF2BP家族蛋白存在與CDR1as相互作用的證據。為進一步驗證,作者進行了RIP分析,發現IGF2BP3對CDR1as的富集作用最強,并且對LINC00632的結合不高,說明IGF2BP3具有特異性結合CDR1as的作用。干擾IGF2BP3可降低由于干擾CDR1as導致的侵襲增強現象。IGF2BP3的RIP-seq能很強的富集CDR1as,作者在黑色素瘤中的數據與已發表的IGF2BP3的RIP-seq或CLIP-seq數據有20~40%的重疊。CDR1as序列中存在大量的IGF2BP3結合位點。


CDR1as干擾前后IGF2BP3結合的靶分子種類沒有太明顯的改變,但CDR1as干擾后變化顯著的基因更傾向于富集到IGF2BP3結合的靶分子列表中。為進一步分析這些基因對CDR1as敲降后促進侵襲的表型的關系,作者進行了小規模RNA干擾文庫的分析,針對CDR1as干擾后表達會增高的9種基因進行RNAi文庫分析,其中6 種基因能顯著逆轉因干擾CDR1as導致的侵襲增加。其中SNAI2 和MEF2C在CDR1as干擾后的表達增高是由IGF2BP3介導的。


圖5 IGF2BP3結合CDR1as,與CDR1as干擾后促進侵襲的表型有關 ([1]


最后,為分析CDR1as表達狀態與黑色素瘤中藥物敏感性和基因型的相關性,作者在Depmap和CTRP的數據中進行了挖掘,并結合CCLE的數據對所有相關細胞中CDR1as表達狀態進行了分組,分為高表達,中表達和低表達三組。有趣的是,作者發現低表達CDR1as 組的細胞對多種MAPK通路的抑制劑更敏感。但在CDR1as高表達的細胞中敲低CDR1as并不能增加細胞對BRAF抑制劑(Dabrafenib)的敏感性。CDR1as表達值與BRAF突變的關系分析表明CDR1as低表達的細胞更高比例攜帶了BRAF突變。有趣的是,高表達CDR1as的細胞對GPX4抑制劑更敏感。sgRNA文庫數據分析也表明,GPX4在CDR1as高表達的細胞系中富集顯著高于CDR1as低表達組。黑色素瘤中GPX4抑制劑的敏感性與MITF / AXL基因的表達有關,MITF低表達且AXL高表達的細胞對GPX4抑制劑更敏感,但對MAPK抑制劑等藥物不敏感。作者分析發現CDR1as高表達的細胞傾向于表現出MITF低表達和AXL高表達,而CDR1as低表達的細胞傾向于表現出MITF高表達和AXL低表達。實驗結果也表明CDR1as表達狀態與GPX4抑制劑敏感性有相關性,低表達CDR1as組的細胞對GPX4抑制劑更敏感。然而在高表達CDR1as的細胞中干擾CDR1as后并不能提高對GPX4的敏感性,說明CDR1as可作為黑色素瘤對GPX4抑制劑敏感性的指標,但并非該藥物發揮功能的關鍵因素。



圖6 CDR1as表達對應于MITF / AXL表達狀態,與GPX4抑制劑敏感性有關 ([1]


本文的發現報道了CDR1as通過結合蛋白調控重要生理活動的機制,大大提高了對CDR1as的功能機制的認知。文章有很多值得學習的技術和思路,概括而言包括以下幾點:

(1)在線資源的有效整合可幫助預測分析和設計相關實驗。文中多次運用了在線數據資源,包括TCGA,GTEx,CLIP-seq,ChIP-seq以及后面分析藥物敏感性和基因突變信息中用到的Depmap,CTRP的數據以及CCLE的數據。這些在線數據能大大提高研究思路和方向設計的效率,從已有數據中挖掘可能的機制和方向。這種做法非常值得學習,也越來越多的用到。

(2)RNA結合蛋白是突破circRNA研究機制單一性的重要思路。CDR1as是最早也是最有影響力的miRNA Sponge模型分子。但本文的實驗分析過程中卻發現miR-7對作者分析的模型并沒有作用,因此提示存在其他的作用機制。生物體本來就是復雜和多維度的,從不同角度發現和認識生物分子的功能是非常必要的。

(3)高通量文庫在探索功能性分子中的價值。本文并沒有從一開始就利用高通量文庫進行篩選分析,但在后面探索CDR1as下游基因與侵襲遷移表型及IGF2BP3結合作用之間的關系時用到了一個只有幾個分子的RNAi文庫體系,用于評價這些基因在相關通路中的作用。后面的Depmap數據則是高通量的RNAi和sgRNA文庫體系的結果,間接的為本文最終的結論提供了幫助。



參考文獻

1. Douglas H., et al., Epigenetic Silencing of CDR1as Drives IGF2BP3-Mediated Melanoma Invasion and Metastasis. Cancer Cell, 2020. 37(1): p. 55-70.

2. Memczak, S., et al., Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency. Nature, 2013. 495(7441): p. 333-8.

3. Hansen, T.B., et al., Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature, 2013. 495(7441): p. 384-8.

4. Piwecka, M., et al., Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function. Science, 2017. 357(6357).

5. Kleaveland, B., et al., A Network of Noncoding Regulatory RNAs Acts in the Mammalian Brain. Cell, 2018. 174(2): p. 350-362 e17.

6. van Heesch, S., et al., The Translational Landscape of the Human Heart. Cell, 2019. 178(1): p. 242-260 e29.


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